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    技術文章

    哪些因素會影響凋亡試劑盒的試驗?點擊次數:12 發布時間:2022-07-25

      凋亡試劑盒廣泛應用于各種傳染性疾病的篩查,如肝炎、HIV,也可應用優生優育等。的試劑、良好的儀器和正確的操作是保證凋亡試劑盒實驗結果準確、可靠的必要條件。試驗中若不做好相關控制,易出現白板、花板、色弱和假陽性等現象。尤其是花板現象(空白、陰性、陽性對照以及室內質控孔結果正常,而標本孔的OD值卻明顯偏高)是各級臨床實驗室常遇到的問題?,F將凋亡試劑盒操作中的影響因素總結如下:
     
      1.標本因素
     
      以辣根過氧化物酶(HRP)為標記的ELISA測定中,殘留在孔內的血紅蛋白具有過氧化物酶樣活性,催化底物顯色造成假陽性;混有紅細胞的血清易沉淀或附著在聚乙烯孔內不易洗凈;如有細菌污染,菌體中可能含有內源性HRP,也會產生假陽性反應;標本凝固不全,在臨床試驗中,有時為了爭取時間而快速檢測,常在血液還未開始凝固時即強行離心分離血清,使血清中仍殘留部分纖維蛋白原,在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊,易造成假陽性結果;采血試管洗滌不徹底、反復使用易交叉污染;塑料試管能吸附抗原物質,樣本久置在塑料管內會使樣本內抗原含量下降造成假陰性。
     
      因此血清標本宜在新鮮時檢測,禁用嚴重溶血的標本。一般說來,在5 d內測定的血清標本可放置于2~8℃,標本在冰箱中保存時間過長易導致血清IgG聚合,使間接法的試劑本底加深。超過1周測定的需-20℃保存。凍結血清融解后,蛋白質局部濃縮,分布不均,應充分混勻并避免產生氣泡?;鞚峄蛴谐恋淼难鍢吮緫入x心或過濾,澄清后再檢測。反復凍融會使抗體效價跌落,所以測抗體的血清標本如需保存做多次檢測,宜少量分裝冰存;使用一次性玻璃試管或真空采血管;并使用非抗凝標本,肝素抗凝血漿會增加OD值,可能與高濃度肝素具有強大的負電荷,能吸附酶標記物,不易洗脫有關;EDTA、酶抑制劑(如NaN3)可抑制凋亡試劑盒系統中辣根過氧化物酶活性;血液標本采集后必須使其充分凝固后再分離血清,或標本采集時用帶分離膠或一次性真空促凝采血管。
     
      2.試劑因素
     
      凋亡試劑盒試劑經歷了從合成肽向基因工程抗原的過渡。由于歷史的原因,人們往往以反應本底的好壞來衡量凋亡試劑盒。因此,有些廠家為了保持較好的本底而采用了單片段基因工程抗原及合成肽包被,該類試劑盒的流行病學敏感度不夠,穩定性也成問題。也有廠家堅持試劑盒高的流行病學敏感度,科學地對待反應結果?;蚬こ炭乖^合成肽抗原有無抗原決定簇的肽片段;二代產品包被的抗原既有基因工作抗原又有合成肽,只是當時的基因工程抗原不全,僅包括了HCV的核心區片段;第三代產品基本上采用了基因工程抗原,而且這些抗原包括更多、更穩定、純度更高的HCV特異性抗菌素原。第三代試劑的敏感度大大提高了?;蚬こ炭乖c合成肽抗原的區別如下:
     
      基因工程抗原是抗菌素原基因在質粒載體中原核或真核表達的蛋白質抗原,多以大腸桿菌或酵母為表達系統。該類抗原與合成肽相比具有以下特點。①分子量大。合成肽采用化學方法制備,由于工藝的局限,合成數量有限,只能達到數百個氨基酸;而利用基因工程制備的抗菌素原,分子量更大。②穩定性好。包被抗原的穩定性決定試劑盒的有效期,早期以合成肽為包裝抗原的試劑盒有效期只有3~4個月,改作基因工程抗原后有效期大大延長了。③基因工程抗原將特異性抗原決定簇基因融合表達,表達產物包含更多的抗原決定簇,可提高試劑盒的靈敏度,提高檢出率。④純化難度大?;蚬こ炭乖募兓夹g難度較大。合成多肽抗原是根據蛋白質抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合成肽抗原有以下特點:分子量太??;一般只含有一個抗原決定簇;純度高;穩定性差。
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